W okupowanej stolicy współtworzył konspiracyjną organizację wojskową, Tajną Armię Polską.
Aby zdobyć materiały wywiadowcze o tworzonych przez Niemców obozach koncentracyjnych, dobrowolnie dał się hitlerowcom uwięzić podczas łapanki w Warszawie. Trafił do Auschwitz. Tam rotmistrz stworzył sprawnie działającą konspirację wojskową, polegającą na wzajemnej pomocy więźniów oraz komunikacji ze światem zewnętrznym. Pilecki wysyłał szczegółowe informacje m.in. o masowym mordowaniu Żydów w komorach gazowych. Oficer miał też zbadać możliwość uwolnienia więźniów, a na końcu uciec i osobiście złożyć raport władzom wojskowym.
W obozie rtm. Pilecki kierował założonym przez siebie Związkiem Organizacji Wojskowej. Wiosną 1943 r. Niemcy rozpoczęli wywożenie Polaków do innych obozów, stąd Pilecki podjął decyzję o ucieczce. „Siedzę tu dwa lata i siedem miesięcy. Prowadziłem tu robotę. Ostatnio nie dostawałem żadnych dyspozycji. Ostatnio Niemcy wywieźli naszych najlepszych ludzi z którymi pracowałem. Trzeba by było zaczynać od początku. Uważam, że moje dalsze siedzenie tutaj nie ma sensu i dlatego wychodzę” – napisał rotmistrz. Tuż po ucieczce z KL Auschwitz rotmistrz przygotowywał plan oswobodzenia obozu wraz z pomocą miejscowej konspiracji placówek Armii Krajowej, jednakże Komenda Główna AK nie wyraziła na to zgody.
W 1943–44 służył w oddziale III Kedywu KG AK. Był uczestnikiem powstania warszawskiego. W latach 1944-45 przebywał w niemieckiej niewoli. Po powrocie do Polski działał w podziemiu antykomunistycznym. W maju 1947 r. został schwytany przez UB, był torturowany i w 1948 r. skazany na karę śmierci. Zamordowano go strzałem w tył głowy 25 maja 1948 r. w więzieniu mokotowskim przy ul. Rakowieckiej. Miejsce jego pochówku nie zostało ujawnione przez władze komunistyczne. Prawdopodobnie ciało rotmistrza wrzucono, wraz z innymi ofiarami, do dołów śmierci na Łączce Cmentarza Wojskowego na Powązkach.
W 1995 r. Witold Pilecki został pośmiertnie odznaczony Krzyżem Komandorskim Orderu Odrodzenia Polski, a w 2006 – Orderem Orła Białego.
